Tecnologia de biossíntese de células-tronco vegetais promove o rápido desenvolvimento da indústria de pesticidas botânicos

As plantas são ricas em carboidratos, proteínas, gorduras e outros nutrientes, bem como um grande número de metabólitos secundários. Tem uma longa história de aplicação na medicina, especiarias, corantes, pigmentos, pesticidas, aditivos alimentares e outros campos [1]. Por muito tempo, os recursos vegetais se tornaram um dos recursos importantes de alimentos e medicamentos para a sobrevivência humana. Os metabólitos secundários das plantas são uma grande classe de pequenos compostos orgânicos moleculares que não são necessários para o crescimento e desenvolvimento das plantas, mas desempenham um papel importante na resistência ao estresse, resistência a doenças e resistência a pragas para a planta.

Atualmente, os metabólitos secundários relatados de plantas incluem principalmente alcaloides, flavonoides, aldeídos, lignanas, etc., com mais de dezenas de milhares de espécies. Agora, alguns metabólitos secundários foram desenvolvidos em produtos comerciais com amplas necessidades sociais e importante valor de aplicação. Por exemplo, a artemisinina é usada para o tratamento de disenteria, a shikonina é usada para antibacteriano, a vanilina e o óleo de rosas são usados como especiarias, a piretrina, a matrina e a veratrina são usadas como pesticidas, osthol, carvacrol e berberina têm sido amplamente usados para o controle de doenças agrícolas.

Com a pesquisa de novos tipos de plantas medicinais e o investimento em tecnologia avançada, mais e mais novos metabólitos secundários de plantas medicinais com alta atividade biológica foram descobertos, e a demanda por recursos vegetais está aumentando. Além da coleta selvagem, o cultivo artificial de plantas medicinais ainda é a principal forma de fornecer matérias-primas. O cultivo artificial tem altos requisitos em sementes de plantas, solo, condições climáticas, etc. É fácil ser infectado com doenças durante o processo de cultivo, e algumas plantas medicinais têm longo tempo de cultivo e altos custos de manejo. Ao mesmo tempo, a contradição entre o cultivo de plantas medicinais e o cultivo de safras tornou-se cada vez mais proeminente [1], a oferta e a demanda de metabólitos secundários de plantas altamente ativos são tensas [2].

Atualmente, é uma maneira eficaz de resolver o problema dos recursos de plantas medicinais usando a tecnologia de biorreação de células-tronco vegetais para alimentar as células únicas de plantas induzidas em grande escala e in vitro para obter um grande número de metabólitos-alvo altamente ativos.

1. Conceito e desenvolvimento de células-tronco vegetais

A cultura de tecidos vegetais e a cultura de células começaram na segunda metade do século XIX. Com base na teoria celular estabelecida por Schleiden e Schwann, o fisiologista vegetal alemão Habedandt apresentou o famoso argumento da “Totipotência das Células-Tronco Vegetais” em 1902 [3], acreditando que as células-tronco vegetais têm a capacidade de se desenvolver em plantas completas in vitro. No entanto, foi somente em 1934 que White [4] estabeleceu o primeiro clone de crescimento ativo usando raízes de tomate isoladas que o experimento de cultura de raízes in vitro foi realmente bem-sucedido pela primeira vez. Vinte e três anos depois, Skoog e Miller [5] descobriram que a cinetina pode efetivamente promover a divisão celular e a regeneração de brotos de explantes. O mais importante é que a alta proporção cinetina/auxina induz a formação de brotos e a baixa proporção cinetina/auxina promove a formação de raízes. Esta descoberta lançou as bases para a regeneração e engenharia celular na cultura de tecidos vegetais e revelou o segredo do hormônio que regula a regeneração de órgãos vegetais. Muir et al. [6] estabeleceram o primeiro sistema de suspensão de células-tronco vegetais usando calo de calêndula. Eles observaram com sucesso que uma única célula pode se dividir em pequenos aglomerados de células por meio do método de alimentação de calo. Em 1958, Steward et al. No mesmo ano, o cientista alemão Reinert [8-9] também obteve resultados de pesquisa semelhantes. Desde então, após mais de 50 anos de verificação contínua por pesquisadores, a totipotência das células-tronco vegetais foi totalmente verificada.

2. Tecnologia de biorreação de células-tronco vegetais

Comparado com técnicas de cultivo convencionais, a cultura de tecidos e células vegetais tem vantagens significativas na produção de metabólitos secundários alvo de plantas medicinais. [10] Ao contrário das plantas cultivadas, a tecnologia de biorreação de células-tronco vegetais usa sistema de produção de reator industrial e processo de recuperação de suporte, e pode realizar operação ininterrupta durante todo o ano com o suporte do sistema de controle automático. Não é afetado pelo ambiente do solo, condições climáticas, estresses bióticos e abióticos. O ambiente asséptico é controlado durante todo o ciclo de cultura, e não há necessidade de usar pesticidas para prevenir a invasão de doenças, insetos e ervas daninhas. Ao mesmo tempo, os nutrientes básicos fornecidos pela biorreação de células-tronco vegetais são baratos, e o custo-benefício é mais significativo em comparação com os sistemas de cultura de células de mamíferos, insetos e leveduras.

Como uma célula chassis de biossíntese, as células-tronco vegetais têm vantagens inerentes na síntese de metabólitos naturais de origem vegetal. Ao contrário das bactérias, as células-tronco vegetais, como sistemas eucarióticos, têm a capacidade de dobrar e montar corretamente proteínas poliméricas. Além disso, as células-tronco vegetais podem realizar modificações pós-traducionais de proteínas que raramente ocorrem em muitos procariontes, adicionando mais possibilidades para a regulação de vias biossintéticas. As células-tronco vegetais não produzirão toxinas bacterianas durante a biossíntese de produtos-alvo, e o sistema de síntese é mais seguro. Além disso, as células-tronco vegetais contêm membrana interna complexa, que pode expressar com sucesso a protease chave no processo de biossíntese primária que precisa ser localizada no sistema plastidial.

Tabela 1. Comparação de diferentes chassis biossintéticos

Espécies	Vantagens	Desvantagens
Germe	Material genético simples, fácil para sequenciamento do genoma, transformação e cultura em larga escala, crescimento rápido e sistema de cultura maduro	É difícil obter modificação pós-traducional, a falta de retículo endoplasmático leva a danos na aromatase CYP450, inibição do substrato e do produto, e pode ter endotoxina bacteriana
Levedura	O material genético é simples, fácil de transformar e de cultura em larga escala, crescendo rapidamente, e o sistema de cultura é maduro	A operação da engenharia genética é complexa e carece de modificação pós-traducional
Alga	Material genético simples, cultivo fácil em escala, autotrófico fotossintético, com modificação pós-traducional e sistema de cultura maduro	Falta de ferramentas eficazes de engenharia genética e longo ciclo de crescimento
Células-tronco vegetais	Cultura fácil de escalar, ferramentas de engenharia genética maduras, taxa de crescimento moderada, modificação pós-traducional, existência de sistema íntimo e poucos problemas regulatórios de células geneticamente modificadas	A aquisição de células-tronco de plantas não modelo é incerta e a rede de regulação metabólica é menos complexa
Planta nativa	Não há necessidade de construir uma via biossintética, a intensidade de trabalho da engenharia genética é baixa, a tolerância à toxicidade é grande e o potencial de produção é grande	Os produtos a jusante são difíceis de processar, têm um longo ciclo de crescimento e consomem muita terra e outros recursos naturais
Síntese Química	Produção fácil de escalar, síntese simples e rápida	É difícil sintetizar metabólitos secundários vegetais com poliquiralidade, envolvendo produtos químicos perigosos, e não é amigável ao meio ambiente, o que é marcado como síntese artificial

 

Os métodos de transformação genética de células vegetais são maduros e estáveis. Com o desenvolvimento de novas ferramentas de edição genética, não é mais difícil regular a expressão de genes alienígenas. Por meio da pesquisa da via metabólica, os genes-chave e as enzimas limitadoras de taxa da rota de biossíntese do produto alvo podem ser operados geneticamente para melhorar a biossíntese do produto alvo. A tecnologia de engenharia genética também pode ser usada para explorar ou criar artificialmente novas rotas biossintéticas para obter outros metabólitos alvo que não são capazes de síntese nas variedades de células de fundo. Combine as vantagens das células chassi com a capacidade sintética dos metabólitos alvo para aumentar significativamente a produção. Ao mesmo tempo, por meio da transformação da reação biológica, o material precursor com baixo valor pode ser convertido no produto alvo com alto valor. Como uma forma eficaz de resolver o problema de recursos, a tecnologia de biorreação de células-tronco vegetais se tornou um dos campos de desenvolvimento importantes da biotecnologia moderna.

Como chassis da biossíntese, as células-tronco vegetais mostram suas vantagens únicas. Células transgênicas ou geneticamente editadas não são variedades vegetais completas e enfrentam menos problemas regulatórios. No entanto, a aquisição de células-tronco nativas de plantas não-modelo é incerta, e o mecanismo de regulação da rede metabólica altamente complexo também traz desafios sem precedentes ao trabalho da biossíntese.

Tabela 2. Casos de síntese biocatalítica de células-tronco vegetais [13]

Espécies de plantas	Substrato	Resultado	Tipo de reação
Tabaco comum	Linalol	Diidrolinalol	Hidroxilação, Glicosilação, Oxidação-redução
Tabaco comum	α- Terpinol	Hidroxiterpinol
Tabaco comum	t-resveratrol	t-paclitaxel
Catharanthus roseus	varfarina	Álcool de varferina
Catharanthus roseus	Geraniol, Nerol, Carvona	Hidroxineo-dihidrocarveol
Astasia longa	Carvona	Diidrocarvona, Isodiidrocarveol
alcaçuz	Papaverina	Papaveritol
Centella Asiática	Tiocolchicina	Derivado de monoglucosil
Papaver	Silibina	Silibina-7-O- β- D-glucopiranosídeo
Papaver	Codona	Codeína
Cenoura	Codona	Codeína

 

3. Tecnologia de biorreação de raízes peludas de plantas

O sistema de produção mais comumente usado em plantas de biorreação de material vegetal é a cultura de suspensão de células-tronco. No entanto, em circunstâncias especiais, alguns metabólitos secundários específicos podem não ser produzidos em tecidos indiferenciados, ou a síntese de alguns metabólitos secundários de plantas é altamente dependente de tecidos e órgãos específicos. A tecnologia de biorreação de raiz peluda fornece outra solução. A tecnologia de biorreação de raiz peluda é usar Agrobacterium rhizogenes para infectar plantas para produzir raízes peludas.

Esta tecnologia não precisa de reguladores de crescimento externos e fontes de luz adicionais, e cresce rapidamente, tem muitas ramificações, e o conteúdo de metabólitos secundários específicos é muito maior do que o da cultura de suspensão celular. A reação biológica da raiz pilosa também é afetada pelos fatores de composição de nutrientes, indutor, precursor e manipulação genética, e é considerada uma das melhores matérias-primas para obtenção de metabólitos secundários vegetais.

Tabela 3. Casos de síntese biocatalítica de raízes peludas de plantas

Espécies de plantas	Substrato	Resultado	Tipo de reação
Ginseng	Digitalina	Digitoxigenina	Esterificação de ácido esteárico, hidroxilação, glicosilação, redox, metoxilação
Tabaco comum	t-resveratrol	t-Pieceatannol, t-Peterostilbeno, Piceid
Lobélia	Ácido gálico	β- Glucosamina
Kaladana	Umbeliferona
Polygonum Multiflorum	1,4-Benzenodiol	Arbutina
Cereja de inverno	Hidroquinona	Arbutina
Tabaco	t-resveratrol	Piceide
Polygonum Multiflorum	Lactona Aescinat	Glicosídeo Aescinat
Datura	Álcool hidroxibenzílico	Gastrodina
Cyanotis Arachnoidea	Artemisinina	Desoxiartemisinina
Angélica Archangelica	Geraniol	Linalol
Angélica Archangelica	Geraniol	Citronelol
Aneto	Geraniol	α- Terpineol
Atropa Beladona	Trimetoxiacetofenona	Trimetoxifeniletanol
Tabaco comum	t-resveratrol	t-Peterostilbeno

 

Atualmente, o uso da tecnologia de biorreação de raiz pilosa como um material adequado para biossíntese e transformação está ganhando vantagens sobre a biorreação de cultura de células-tronco de plantas. Elas têm muitas vantagens, incluindo estabilidade bioquímica e genética, baixa sensibilidade a mudanças nas condições de cultura, potencial enzimático muito semelhante às plantas-mãe e baixo custo.

 

4. Status de desenvolvimento e progresso da pesquisa da cultura de células-tronco vegetais

• Situação da Industrialização Global

Ao longo dos anos, houve um grande progresso na produção de ingredientes medicinais por meio da tecnologia de biorreação de células-tronco vegetais. Atualmente, há mais de 400 tipos de plantas que foram estudadas e podem produzir mais de 600 tipos de componentes metabólicos primários e secundários, dos quais uma parte considerável tem valor medicinal, e algumas alcançaram com sucesso a produção industrial. Já em 1956, Routier e Nickell nos Estados Unidos propuseram uma patente para a síntese de produtos naturais a partir da cultura de células-tronco vegetais [10]. Em 1983, a Mitsui Petrochemical Company do Japão anunciou a produção industrial de shikonin como corante e medicamento. Além disso, a produção industrial de digoxina a partir da cultura de células de rehmannia por meio de biotransformação, cultura de células de coptis chinensis para produzir coptidina e cultura de raiz de ginseng para produzir ginsenosídeo foi realizada. Outras culturas de células, como catharanthus roseus e perilla frutescens, também atingiram o nível piloto [12]. Por meio da tecnologia de cultura de células-tronco de Taxus chinensis, a biossíntese de taxol atingiu 1045mg/L, o que foi mais de 298 vezes maior do que a planta-mãe. A síntese total de glicosídeos de Centella asiatica atingiu 1670mg/g DW, o que atendeu totalmente às necessidades da industrialização. A Belgium Green2chem e a France Naturex e outras empresas usaram ativamente a tecnologia de reação biológica de raiz peluda de plantas e alcançaram com sucesso a biossíntese de mais de 20 ingredientes medicinais de alto valor, como nicotina, cilimarina, paclitaxel, quinina e forskolina. Na China, a Newland Biology estudou microbolhas de células vegetais como meio de administração de medicamentos. Em 2018, a empresa concluiu o financiamento da rodada anjo e construiu equipamentos de reação biológica de células-tronco vegetais de mais de toneladas. No início de 2022, a American Phyton investiu 3 bilhões de yuans para iniciar a construção da "superfábrica" de reação biológica de células-tronco vegetais PCF em Xuzhou. Após a conclusão, a receita de vendas esperada atingirá 7 bilhões de yuans.

 

• A biossíntese impulsiona o rápido desenvolvimento da indústria de pesticidas botânicos

Alguns passos podem levar a milhares de quilômetros. Chengdu Newsun Crop Science Co., Ltd. (doravante denominada “Newsun”) tem se concentrado no desenvolvimento da agricultura verde por mais de 20 anos desde sua criação, e é uma empresa líder em tecnologia de biopesticidas botânicos na indústria. Os ingredientes ativos dos pesticidas botânicos são principalmente metabólitos secundários naturais e altamente ativos, que têm as características de rápida degradação, boa compatibilidade ambiental, baixo resíduo, etc., que estão em linha com a tendência atual de desenvolvimento de proteção ambiental, e a demanda do mercado continua a crescer. No entanto, com o avanço da industrialização, o problema dos recursos vegetais medicinais logo se tornará um gargalo técnico na aplicação de produtos naturais altamente ativos.

 

A Newsun fez progressos importantes na pesquisa de tecnologia de biorreação de células-tronco vegetais por meio de indução de calos, cultura de suspensão de células-tronco vegetais, indução de raiz pilosa e outras tecnologias de cultura de células-tronco vegetais.

 

A Newsun obteve mais de 10 tipos de materiais de células de chassis de plantas com potencial para desenvolvimento de biossíntese por meio da tecnologia de indução de células-tronco de tecido vegetal. Após a otimização das condições de reação biológica, o rendimento de células-tronco atingiu 550g/L. Por meio da tecnologia de engenharia genética, a expressão heteróloga do chassis do metabólito alvo foi alcançada com sucesso, e a reconstrução de genes-chave da via metabólica de múltiplas células de engenharia foi concluída. E alcançou com sucesso a pesquisa da tecnologia piloto de biossíntese de metabólito alvo. Ela estabeleceu uma base sólida para avançar a meta técnica de industrialização de variedades de produtos naturais alvo.

 

5. Perspectiva da tecnologia de biorreação de células-tronco vegetais

A coleta cega de longo prazo de plantas medicinais raras levou à destruição do ambiente ecológico. Muitas plantas selvagens estão ameaçadas. É difícil introduzir plantas em alguns ambientes ecológicos especiais. As plantas que podem ser introduzidas e cultivadas precisam ocupar uma grande quantidade de terras agrícolas. Sob a restrição da área cada vez mais reduzida de terras agrícolas e a garantia da linha vermelha de 1,8 bilhões de mu (1ha = 15mu) de terras agrícolas na China, o cultivo em larga escala de plantas medicinais é seriamente restrito. Além disso, o cultivo artificial é restrito por fatores ambientais. O conteúdo de metabólitos secundários alvo em plantas naturais é muito baixo e a composição é complexa, o que cria uma barreira de alto custo de desenvolvimento para utilização industrial. Devido à estrutura complexa de produtos farmacêuticos naturais altamente ativos e ao grande número de centros quirais, a tecnologia de síntese química tradicional não conseguiu atender às necessidades da tecnologia de produção. Diante de muitos dos problemas acima, os trabalhadores científicos têm grande importância social para produzir metabólitos secundários úteis [14-16] explorando um grande número de tecnologias de cultivo de células-tronco e órgãos de plantas superiores.

De acordo com A Análise da Situação Atual da Concorrência na Indústria de Pesticidas Botânicos da China e o Relatório de Pesquisa sobre Estratégia de Investimento Empresarials, a China é um grande produtor e usuário de pesticidas no mundo, enquanto a proporção de pesticidas biológicos (incluindo antibióticos agrícolas) na quantidade total de pesticidas é inferior a 12,5%, muito abaixo do nível médio internacional. Os biopesticidas são apoiados por políticas nacionais, em linha com a tendência atual de consumo de proteção ambiental, e o crescimento do mercado é rápido. Como as principais espécies de pesticidas biológicos, os pesticidas botânicos têm amplas perspectivas de desenvolvimento.

Jornal de Chengdu, como uma empresa de tecnologia de biopesticidas envolvida na pesquisa e desenvolvimento de biotecnologia original, está comprometida em resolver o gargalo da industrialização de pesticidas botânicos por meio do avanço inovador da tecnologia de reação biológica de células-tronco vegetais e fazer contribuições para a proteção do ambiente ecológico e a promoção do desenvolvimento agrícola verde. No futuro, a Newsun continuará a tomar as colheitas como a direção da pesquisa científica, continuará a melhorar o efeito de controle e reduzir o custo de uso de pesticidas botânicos e promoverá o rápido desenvolvimento da indústria de pesticidas botânicos.

 

Site da Newsun Crop Science: http://www.cdxzy.com

E-mail: [email protected]

Referência:

[1] Wang Wenlan, Huang Xianrong, Zhang Liping PROGRESSO DA PESQUISA NA CULTURA DE FERMENTAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO DE PLANTAS MEDICINAIS [J] Journal of Practical Medicine, 20070724 (07)

[2] Hu Shanqun, Liang Rudai, Li Tong, etc. PROGRESSO DA PESQUISA EM TECNOLOGIA DE CULTURA DE CÉLULAS EM SUSPENSÃO DE PLANTAS MEDICINAIS [J] Tecnologia de sementes, 2021, 18 (0007)

[3] Haberlandt G. Culturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Akad Wiss Wien Math-naturw Classe, 1902, 61: 1–23.

[4] White P R. Crescimento potencialmente ilimitado de pontas de raízes de tomate excisadas em meio líquido[J]. Fisiologia vegetal. 1934, 9: 585-600.

[5] Skoog F, Miller C O. Regulação química do crescimento e formação de órgãos em tecidos vegetais cultivados in vitro. Symp Soc Exp Biol, 1957, 11:118–130.

[6] Muir WH, Hildebrandt AC, Riker A J. Culturas de tecidos vegetais produzidas a partir de células isoladas. Science, 1954, 119: 877–878.

[7] Steward FC, Mapes MO, Mears K. Crescimento e desenvolvimento organizado de células cultivadas. II. Organização em culturas cultivadas a partir de células livremente suspensas. Am J Bot, 1958, 45: 705–708.

[8] Reinert J. Morphogenese e seu controle de cultura de caroteno. Naturwissenschaften, 1958, 45: 344–345.

[9] Reinert J. Supere o controle da morfogênese e a indução dos embriões adventícios e da cultura do karotten. Planta, 1959, 53: 318–333.

[10] Li Sheng, Li Wei PRINCÍPIOS E TÉCNICAS DE CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS [M] Pequim: Chemical Industry Press, 2007, 10

[11] Luo Kai, Hu Tingzhang, Luo Jianping, PROGRESSO DE PESQUISA NA PRODUÇÃO DE METABOLITOS SECUNDÁRIOS POR CULTURA DE CÉLULAS-TRONCO VEGETAL [J] Shizhen Guoyi Guoyao, 2007, 18 (10)

[12] Yu Fang ESTABELECIMENTO DO SISTEMA DE CULTURA CELULAR DE CAMPTOTHECA ACUMINATA E BIOSSÍNTESE E REGULAÇÃO DO PROCESSO DE CAMPTOTECINA A E B [D] Universidade de Tecnologia de Dalian, 2005

[13]Abdulhafiz Ferid, Mohammed Arifullah, Reduan Mohd Farhan Hanif, et al. Tecnologias de cultura de células vegetais: Uma alternativa promissora para produzir metabólitos secundários de alto valor[J]. Arabian Journal of Chemistry, 2022, 104161.

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[15] Dai Jungui BUSCANDO O PROGRESSO DA PESQUISA BIOTECNOLÓGICA DA MEDICINA TRADICIONAL CHINESA DO MUNDO. Capital Medicine, 2001, 8 (5): 4.11

[16] Godian O PAPEL DA BIOTECNOLOGIA NA MODERNIZAÇÃO DA MEDICINA TRADICIONAL CHINESA Foreign Medicines and Botanicals, 1998, 13 (6): 257